猴痘病毒是一種包膜雙鏈DNA病毒，主要通過呼吸道飛沫、體液、分泌物、傷口或病毒污染物進(jìn)行傳播。人感染猴痘會出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、咳嗽、淋巴腫大等癥狀，還可能并發(fā)細(xì)菌感染、敗血癥、肺部感染、呼吸窘迫綜合癥等。阻斷猴痘病毒的傳播主要以預(yù)防為主，同時對病原檢測及時發(fā)現(xiàn)病毒阻斷病毒的傳播顯得十分重要。一般來說，qPCR是猴痘病毒首選的實驗室檢測方案，但從對抗新冠疫情中得到的經(jīng)驗教訓(xùn)表明，預(yù)防突發(fā)大流行的源頭是向個人提供快速可靠的即時診斷工具，抗原檢測在新冠病毒檢測中扮演了這一角色，但也暴露出抗原檢測的準(zhǔn)確度仍亟待提升的問題。對于猴痘病毒，其抗原的低特異性使其更容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，因此猴痘病毒的即時診斷難以通過抗原檢測的方式實現(xiàn)。

近日，一項發(fā)表于《Sensors and Actuators B: Chemical》的研究介紹了一款特殊的猴痘病毒檢測裝置，該裝置包含了以RPA和CRISPR-Cas12a技術(shù)作為原理的凍干型檢測試劑，可在35分鐘內(nèi)完成對猴痘病毒的快速自測。

01RPA-CRISPR/Cas12a檢測猴痘的策略

該檢測的原理首先利用了RPA法對猴痘病毒核酸指數(shù)級擴增的能力，將得到的擴增產(chǎn)物與預(yù)先設(shè)計好的gRNA和Cas12a酶組成的RNP復(fù)合物結(jié)合，RNP復(fù)合物與猴痘病毒特異性擴增產(chǎn)物的相互作用激活了Cas12a酶的反式切割活性，導(dǎo)致ssDNA報告探針被切割而產(chǎn)生可檢測的熒光。另外，RPA和CRISPR/Cas12a的反應(yīng)體系具有很好的兼容性，這種集成的RPA-CRISPR/Cas12a反應(yīng)可以在單一的溫度和單個試管中進(jìn)行，避免了氣溶膠污染的風(fēng)險，并且提高了檢測的靈敏度和特異性（圖1）。

圖1.CRPA-CRISPR檢測猴痘病毒的基本原理

02CRISPR 解決恒溫擴增非特異的困局

研究人員選取了猴痘病毒的B6R和F3L基因作為檢測的靶標(biāo)，并針對這兩個基因篩選了多對RPA引物。盡管如此，在對模擬樣本進(jìn)行獨立RPA擴增測試的過程中仍出現(xiàn)了較多的非特異性擴增，這與RPA方法的擴增原理相關(guān)。為了解決檢測過程中非特異性擴增的問題，研究人員嘗試將CRISPR-Cas12a核酸檢測技術(shù)與RPA方法相結(jié)合，并分析相同的樣品。結(jié)果證明該方法使檢測的特異性得到了明顯的提升，CRISPR-Cas12a識別了RPA擴增子的特定序列，并將其與非特異性擴增的產(chǎn)物區(qū)分開來（圖2）。

圖2. RPA與CRISPR技術(shù)相結(jié)合的必要性

03基于CRISPR的猴痘病毒POCT檢測裝置

在成功開發(fā)了RPA-CRISPR / Cas12a檢測方法后，研究人員將所有試劑進(jìn)行凍干并集成到一個便攜式的MASTR袋中以檢測猴痘病毒。MASTR 袋中的主要組件包括迷你移液器、即用型管、采樣管、迷你移動電源、自動讀出裝置和迷你恒溫加熱塊，通過檢測在RPA-CRISPR/Cas12a部分的同一批次樣品來驗證MASTR袋的可行性，用于檢測質(zhì)粒和病毒。測試結(jié)果表明，陽性結(jié)果發(fā)出明亮的熒光，陰性結(jié)果僅存在較低的背景信號；證明 MASTR 袋具有便攜和操作簡單的特點，且沒有假陽性的結(jié)果（圖3）。

圖3. 基于RPA-CRISPR凍干試劑的即時診斷裝置

研究人員還使用MASTR袋測試了各種類型的模擬臨床標(biāo)本，結(jié)果表明MASTR袋擁有與qPCR實驗室測試相當(dāng)?shù)奶禺愋耘c靈敏度，證明了MASTR袋檢測猴痘病毒的準(zhǔn)確性（圖4）。

圖4. MASTR袋的性能驗證 

盡管如此，該研究在也存在一定的局限性，主要體現(xiàn)在未能獲得并檢測真實的猴痘臨床標(biāo)本，但這與當(dāng)前猴痘患者的總體數(shù)量稀少相關(guān)。不可否認(rèn)的是，這款RPA-CRISPR凍干型裝置在猴痘病毒的即時檢測方面具有較大的潛力，有望通過早期疾病的檢測來幫助防控猴痘疫情。 

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