載體是攜帶目的基因進入宿主細胞的運載工具，是分子克隆技術不可或缺的重要組成部分，其中，質粒是最常用的載體。面對日益繁多的質粒，正確閱讀質粒圖譜是進行分子克隆的前提。本文將介紹如何閱讀質粒圖譜。

 

一、質粒的概念及分類

1.概念

      質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質粒常見于原核細菌和真菌中，絕大多數(shù)的質粒是DNA型的，少部分為RNA型。天然DNA質粒大都具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，其分子量范圍為1-300 kb。

天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足基因工程載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建，所以目前使用的質粒多為人工改造的質粒。

理想的質粒應滿足以下條件：

①復制能力：具有獨立的復制能力，在細胞中能大量繁殖，從而使目的基因大量擴增；

②表達能力：作為表達載體應能利用宿主的酶系統(tǒng)，表達目的基因； 

③穩(wěn)定性高：細胞內能持續(xù)復制和表達；

④酶切位點：具有適當?shù)南拗菩院怂醿惹忻缸R別和切割位點，即外源基因插入部位；

⑤遺傳標記：便于重組體的篩選和鑒定；

⑥分子量?。阂匀菁{較大的外源基因。

2.分類

（1）按功能分類:克隆載體、表達載體

       克隆載體（cloning vector）：具有克隆載體的基本元件（復制起始位點,抗性基因,多克隆位點等)，可以攜帶DNA片段或外源基因進入受體細胞并克隆和擴增DNA片段或基因的載體。

表達載體（expression vector）：除了具有克隆載體的基本元件外，還有可以表達調控目的基因的元件，即轉錄翻譯所必需的DNA序列。

（2）按受體細胞的類型分類：原核載體、真核載體和穿梭載體

       原核載體（prokaryotic vector）：能在原核細胞中復制和表達的載體真核載體（eukaryotic vector）：能在真核細胞中復制和表達的載體

穿梭載體（shuttle vector）也叫轉移載體（transfer vector），指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）。穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子，以確保能夠在原核和真核兩種宿主細胞中復制與擴增，并可以在真核細胞中有效表達。

 

二、質粒的基本元件

1.復制起點（Origin of replication，ori）

       DNA復制起始位點ori負責控制質粒復制的起始，原核生物DNA分子中只有一個復制起始位點；而真核生物DNA分子有多個復制起始位點。若質粒圖譜上只有一個ori，表示質粒是原核克隆及表達質粒；而圖譜上有兩個ori，則表示該質粒是穿梭質粒，既可以在原核也可以在真核中復制。

2.啟動子（promoter, P）

       與RNA聚合酶特異性結合，促進基因轉錄的DNA序列。含有RNA 聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列。

真核細胞含有三類RNA聚合酶，因此真核啟動子還分為I、II、III類啟動。常見表達或者過表達都是II類啟動子，而III類啟動子如U6、H1，啟動小片段如miRNA、shRNA、sgRNA等，其用于構建shRNA和sgRNA載體進行敲低或敲除操作。

Ⅱ型啟動子在使用特點上又可分為三大類：組成型啟動子（廣泛性啟動子）、組織特異性啟動子、誘導型啟動子。

此外，不同物種的表達體系具有不同的啟動子，啟動子啟動基因表達也有強弱之分，因此我們需要根據(jù)自己的需求選擇含有相應啟動子的質粒。關于啟動子的詳細介紹見往期推文。

3.增強子（enhancer）：增強目的基因轉錄

4.篩選標記（selectable markers）

       多為抗生素抗性基因，方便后續(xù)篩選陽性克隆。原核細胞篩選標記常用的是氨芐青霉素/氨芐西林Amp、氯霉素Cam、卡那霉素Kan、四環(huán)素Tet等；真核細胞篩選標記用的是嘌呤霉素Puro，新霉素neo/G418，潮霉素Hyg或Hygro等。質粒圖譜中用抗生素縮寫+R表示，R代表resistance，如AmpR和PuroR等。

抗生素作用機制及用途見下表

 

5. 多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）

       外源 DNA的插入位點，通常位于啟動子的下游，具有多個核酸內切酶的酶切位點，可通過酶切/連接方式將外源 DNA 插入到質粒。質粒圖譜中有些酶切位點右上角標注了“*”，代表可能并不僅僅存在單一限制位點，所以一般不選用標有星號的酶切位點。

6.轉錄終止信號（polyA  signal）

       轉錄到AAUAAA（AATAAA）之后，mRNA會接上polyA并轉錄終止。常見的轉錄終止信號位SV40 polyA，簡寫為SV40 pA

7. 熒光基因

      可以用激光激發(fā)產生熒光的蛋白，一般會獨立表達或和目的基因融合表達的方式被設計在質粒上，起到示蹤、陽性檢測、成像的作用。如RFP、mCherry、GFP和EGFP等。

8.蛋白標簽

      蛋白標簽大多為較短的短肽，一般融合表達在目的基因的3’端或5'端，如flag、HA、myc和his等。有了標簽，在缺乏針對目的蛋白的抗體時就可以很方便的對目的蛋白做檢測了

9.其他調控元件

WPRE：來自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調節(jié)元件，放置在目的基因的上游，能加強目的基因的表達。

cPPT：來自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度。

 

三、如何閱讀質粒圖譜

以pLKO.1-Puro質粒（常用于構建shRNA載體）為例，對質粒圖譜進行解讀

 

1.首先看箭頭方向

      質粒圖譜上都會存在箭頭，箭頭方向可以代表轉錄方向如圖中U6、hPGK、AmpR等啟動子（白色箭頭）的方向，也可以代表復制方向，即 ori（黃色箭頭）的箭頭方向。設計引物及插入目的基因的方向是根據(jù)轉錄方向（啟動子方向）來定的。由于質粒是環(huán)狀雙鏈DNA，箭頭可有順時針和逆時針方向，代表兩條DNA鏈，它的啟動子在其中一條鏈上，而它的某些基因在另一條鏈上。

2.看ori鑒別質粒類型

      前文提到，若質粒圖譜上只有一個ori，表示質粒是原核克隆及表達質粒；而圖譜上有3個ori，則表示該質粒是穿梭質粒。因此該質粒為穿梭質粒。

 

 

 

3.看啟動子確定質粒的作用

       該質粒圖譜中有7個啟動子（白色箭頭），U6啟動子可用于構建shRNA和sgRNA載體；hPGK和AmpR啟動子啟動Puro和Amp抗性基因的表達，可用于篩選陽性克隆。T3和T7啟動子分別是噬菌體T3和T7 RNA聚合酶的啟動子，lac啟動子是大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子，RSV啟動子是rous肉瘤病毒增強子/啟動子。

 

4.看篩選標記/抗性基因

       圖中有AmpR（氨芐西林抗性基因）和PuroR（嘌呤霉素抗性基因），AmpR用于原核細胞如大腸桿菌篩選，PuroR用于真核細胞如腫瘤細胞的篩選。當大腸桿菌和腫瘤細胞中不存在該質粒時就無法表達抗性基因，因此應用氨芐西林或嘌呤霉素可以篩選出陽性克隆。各抗生素作用機制與用途見前文。

 

5.看多克隆位點

       該質粒圖譜中圓圈外圍的黑體字母代表酶切位點，可用于插入外源基因。pLKO.1-Puro質粒常用于構建shRNA載體，插入的shRNA靶序列位于U6啟動子下游且緊鄰U6啟動子。針對該質粒，我們常選用AgeI和EcoRI這兩個酶切位點引入外源shRNA靶序列。

 

6.看轉錄終止信號

       質粒圖譜中pA或者poly A代表轉錄終止信號。

 

7.熒光標記

      有的質粒帶有熒光標記，用于直觀判斷質粒是否轉染成功。如下圖所示，與pLKO.1-Puro相比，pLKO.1-EGFP-Puro主要不同在于多了CMV啟動子/增強子和EGFP序列（箭頭表示），CMV啟動子啟動EGFP（增強的綠色熒光蛋白）的表達。其余部分與pLKO.1-Puro相差不大。

 

 

8.其他

        回到pLKO.1-Puro質粒，長末端重復序列（long terminal repeats，LTR）存在于反轉錄病毒基因組的兩端，即5’ LTR和3’LTR，不編碼蛋白質，但含有啟動子，增強子等調控元件。

cPPT來自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度。

M13 fwd和M13 rev是M13上下游通用引物，可用于后續(xù)測序。

CAP binding site（CAP結合位點）在cAMP存在時激活轉錄。

HIV-1Ψ是人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的包裝信號。 

RRE（Rev response element）允許Rev依賴的mRNA從細胞核輸出到細胞質。

gp41 peptide介導HIV與CD4細胞融合，從而HIV進入細胞內。

 

想必通過上面的講解，大家對質粒圖譜的閱讀應該有大致的了解，那就找?guī)讖堎|粒圖譜練習吧。可在addgene網站（https://www.addgene.org/）搜索想要的質粒。如圖：

 

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