背景

      短時間內進行大量新冠病毒檢測是控制新冠病毒傳播的關鍵之一，發(fā)展可現(xiàn)場診斷的檢測設備有利于促進新冠肺炎的早期干預和治療，并有效降低疾病傳播風險。重組酶聚合酶擴增（RPA）以及重組酶介導擴增（Recombinase aided amplification，RAA）因其快速、簡便、等溫而成為現(xiàn)場診斷的首選擴增技術，但可能存在非特異性擴增的假陽性問題。規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）具有良好的特異性和可靠性。RPA與CRISPR的結合可以兼具靈敏度和特異性，在開發(fā)下一代POCT分子診斷技術方面具有廣闊前景。然而，目前大多數(shù)CRISPR/Cas輔助RPA方法包含前擴增子的轉移和多種人工操作，使測試過程復雜化，增加了污染風險，而少數(shù)一鍋法的反應又需要較長的反應時間。

     近期，南方科技大學的研究人員開發(fā)了一種雙CRISPR/Cas12a輔助的逆轉錄-重組酶介導擴增（RT-RAA）檢測方法和“樣本進-結果出”的離心微流控平臺，該平臺可在30min內自動檢測1拷貝/μL的新冠病毒（SARS-CoV-2），具有一步、自動化、快速和靈敏的優(yōu)點，在臨床診斷和疾病預防方面具有重大潛力。相關研究成果以“Dual-CRISPR/Cas12a-Assisted RT-RAA for Ultrasensitive SARS-CoV?2 Detection on Automated Centrifugal Microfluidics”為題發(fā)表于Analytical Chemistry期刊。

      該基于雙CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA的自動化微流控平臺操作流程和工作原理如圖1所示，RT-RAA和CRISPR/Cas12a試劑分別通過冷凍干燥的方式預裝入擴增室和檢測室進行長期保存。操作人員只需加入核酸樣品溶液，并將芯片放置在相應的檢測儀器上，即可在30分鐘內自動完成擴增-檢測-報告流程。針對新冠病毒的E基因序列設計RT-RAA引物、Cas12a-crRNA序列，并引入標記FAM和BHQ-1的單鏈核酸報告序列。由于兩個crRNA識別不同的位點，每個擴增子都可以激活兩個CRISPR/Cas復合物，此雙活性復合物顯著提高了ssDNA-FQ報告基因的切割率，更有利于低濃度模板RNA的RT-RAA系統(tǒng)的檢測。

圖1 CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA的超敏檢測SARS-CoV-2的自動化離心微流控平臺

      研究人員首先驗證了基于雙CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA系統(tǒng)的可行性和靈敏度。引入CRISPR/Cas12后，可見空白組非特異性熒光信號明顯降低。相較于單一crRNA，雙crRNA策略的熒光信號最強，且實時熒光增長速度最高。此外，也通過凝膠電泳驗證了雙crRNA策略的可行性，如圖2a所示，加入混合crRNA樣品后，不僅生成了片段-F和片段-R，還生成了最短的片段-M。接著，研究人員采用無需開蓋的一鍋法測定該法的靈敏度（將CRISPR/Cas12a體系放在蓋帽，RT-RAA體系放在管內），熒光成像和測定結果如圖2b所示，該法可檢測到低至約10個拷貝的SARS-CoV-2的E基因。

圖2 雙CRISPR/Cas12a法靈敏快速檢測SARS-CoV-2

       鑒于微流控平臺在微尺度流體自動控制方面的優(yōu)勢，該研究將雙CRISPR/Cas12a輔助的RT-RAA法引入微流控平臺（圖3）。該平臺由三層組裝而成，分別為注射層（1mm）、連接層（1mm）和反應層（2mm）。其中，進樣層上的8個進樣孔（Φ=1mm）與移液管的20μL完美貼合，出樣孔（Φ=0.5mm）保證樣本量順利進入樣品腔。連接層上的連接通道可以保持密封芯片內樣品腔與預分配腔之間的壓力平衡。反應層上的600μm寬通道可以保證樣品在低轉速800轉/分鐘時順利進入放大腔。擴增室與檢測室之間的100μm窄通道和毛細管閥可以防止低轉速下的樣品進入檢測，只有在轉速達到3000轉/分鐘時才能使樣品進入檢測室。該芯片可以同時進行32項測試，只需要兩次樣品轉移和兩步反應，可認為是一種低成本、直接檢測的離心微流控平臺。圖4a-b顯示了該微流控平臺的采樣過程、檢測儀器和檢測流程。此外，采用不同顏色清晰地顯示不同階段的流動狀態(tài)，將CuSO?和海藻糖/聚蔗糖的混合物通過冷凍干燥的方式預加載到芯片中（圖4c）。當以800轉/分鐘低速旋轉時，黃色酸性FeCl?溶液（代表目標溶液）進入擴增室，變?yōu)榫G色，藍色檢測室表示無液體進入檢測室。而當轉速提高到3000轉/分鐘時，溶液進入檢測室并變?yōu)榫G色，因此該芯片按照預期逐步完成樣品轉移。

圖3 離心微流控芯片的結構

圖4 離心微流控芯片的結構和自動化微流控平臺的工作流程

       接著，研究人員對該微流控平臺的靈敏度進行了考察，如圖5所示，該法的檢出限為1拷貝/μL。此外，對34份SARS-CoV-2臨床標本（26例陽性，8例陰性）進行了實際應用，采用商用RT-qPCR作為金標準，增加Orf1ab基因為補充靶基因增加檢測的準確性，結果顯示，對于閾值循環(huán)數(shù)（Ct）＜30的RT-qPCR檢測樣品，CRISPR檢測在10分鐘內達到最大熒光信號，定義為“強陽性”樣品；Ct＞30的RT-PCR檢測樣品，CRISPR檢測在10分鐘后無法達到最大熒光，被定義為“弱陽性”樣品。因此，該雙CRISPR/Cas12a輔助RT-RAA微流控平臺提供了一種直接、快速、自動化的方法，有潛力開發(fā)用于SARS-CoV-2檢測的POCT診斷。

圖5 基于雙CRISPR/Cas12a輔助RT-RAA的自動微流控平臺上檢測SARS-CoV-2

      綜上所述，該研究提供了一種基于雙CRISPR/Cas12a輔助RT-RAA微流控平臺方法，實現(xiàn)了SARS-CoV-2快速、現(xiàn)場、自動化、超靈敏的檢測要求，在開發(fā)下一代POCT分子診斷技術方面具有很大的潛力，可用于家庭或小型診所的傳染病快速檢測。為了實現(xiàn)更好的實際應用，今后改進和發(fā)展方向如下：（1）通過注射成型的方法制作微流控芯片，滿足定標需求；（2）優(yōu)化冷凍干燥技術參數(shù)，延長芯片的存儲時間;（3）將檢測結果無線傳輸?shù)骄W(wǎng)站或報告服務器，實現(xiàn)簡單、快速、智能、互聯(lián)的疾病診斷和跟蹤;（4）同時檢測和鑒別其他病毒感染，以實現(xiàn)有效的疾病治療和管理等。

論文鏈接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c00638  

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