PCR革新技術(shù)-英國TwistDx Inc公司開發(fā)恒溫擴(kuò)增RPA 

        自PCR技術(shù)誕生以來已經(jīng)有三十年了。從經(jīng)典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。近年來，等溫擴(kuò)增技術(shù)的興起無疑是對PCR的巨大挑戰(zhàn)。
        等溫擴(kuò)增技術(shù)的基因快速診斷方法,涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體是用體外生物檢測試劑快速檢測病原微生物的一種技術(shù)。
包括如下步驟:一、對被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理;二、包括目標(biāo)靶基因數(shù)據(jù)庫的建立;生物信息學(xué)的分析比較;基因組多態(tài)性的分型處理和簡并堿基的運(yùn)用,獲得各種靶基因的特異性引物兩對,分別與靶基因中的六個獨(dú)立區(qū)域序列特異性匹配;三、進(jìn)行等溫擴(kuò)增反應(yīng);四、分析判斷結(jié)果。該方法的優(yōu)點(diǎn):不需特殊試劑與設(shè)備;高特異性;.靈敏度高;鑒定簡便;用途廣: 可用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域的質(zhì)量控制和環(huán)境、水質(zhì)等監(jiān)測;用于醫(yī)學(xué)臨床診斷,用于代謝性疾病和遺傳疾病的基因診斷。
         英國TwistDx Inc公司開發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)--被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)，目前全球最新的等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp? 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物防御、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
         常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的最適溫度在37°C - 42°C之間，無需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。
        據(jù)介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂?尤其是DNA)模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。
        RPA既可以擴(kuò)增DNA也可以擴(kuò)增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測，還可以對擴(kuò)增過程進(jìn)行實時監(jiān)控，甚至可以通過試紙條(側(cè)流層析試紙條LFD)讀取結(jié)果。
        目前，TwistAmp? 試劑盒的擴(kuò)增子長度在500bp以內(nèi)。不過，經(jīng)過特別優(yōu)化的RPA擴(kuò)增，也可以生成更長的擴(kuò)增產(chǎn)物，或者減慢擴(kuò)增速度(便于定量)，甚至在更低的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。
        RPA技術(shù)的基本原理
        RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右。
        重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進(jìn)行得非?？?，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴(kuò)增所需的所有試劑，我們只要準(zhǔn)備好引物和模板就行。擴(kuò)增結(jié)果可以通過凝膠電泳進(jìn)行終點(diǎn)檢測，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。
在這個基礎(chǔ)體系中添入不同的酶和探針，就可以實現(xiàn)多樣化的RPA應(yīng)用。舉例來說，TwistAmp? Basic RT添加了逆轉(zhuǎn)錄酶，可以對RNA模板進(jìn)行一步法擴(kuò)增。TwistAmp? exo結(jié)合了專利的exo探針技術(shù)和核酸外切酶III，能實現(xiàn)數(shù)據(jù)的實時讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應(yīng)終點(diǎn)的擴(kuò)增子總量有所減少，適合獲得強(qiáng)熒光信號進(jìn)行動力學(xué)分析，不適合終點(diǎn)檢測(比如跑膠)。將exo探針技術(shù)、核酸外切酶III和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合起來的 TwistAmp? exo RT，可以一步實現(xiàn)RNA模板的實時擴(kuò)增。
        TwistAmp? fpg是一個添加了核酶fpg的實時報告體系。fpg探針技術(shù)的熒光累積比較慢，但終點(diǎn)的擴(kuò)增子產(chǎn)量不會減少，因此也能支持終點(diǎn)分析。TwistAmp? nfo加入了核酶nfo，可以用“三明治法”進(jìn)行終點(diǎn)檢測，比如測流層析試紙條LFD。
除此之外，RPA擴(kuò)增還可以很簡單的實現(xiàn)多重化。只需要增加引物/探針就可以一次性檢測多個擴(kuò)增產(chǎn)物。
        RPA分析的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達(dá)到30-38個堿基。引物過短會降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度。
        在設(shè)計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴(kuò)增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設(shè)計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。雖然還沒有設(shè)計軟件可以使用，不過TwistDx Inc公司在自己的網(wǎng)站上提供了相應(yīng)的篩選指南。
需要注意的是，目前的TwistAmp? 擴(kuò)增試劑盒都沒提供RNase抑制劑。另外，受目前的生產(chǎn)方法所限，RPA反應(yīng)不適合用于E. coli標(biāo)準(zhǔn)實驗室菌株的擴(kuò)增。

RPA 便攜、等溫，可替代 PCR ，非常適合用于分子檢測試劑、動物、食品安全、生物防御和農(nóng)業(yè)中。
速度—— 檢測時間 15 分鐘以內(nèi)；
敏感度—— 單分子檢測，不需要  thermocyler ；
簡單—— 穩(wěn)定的凍干試劑，幾乎沒有硬件要求的可靠等溫技術(shù)。
1.TwistAmp Basic  試劑盒（ 96 次）
2.TwistAmp exo  試劑盒（ 96 次）
3.TwistA m p nfo  試劑盒（ 96 次）
4.TwistAmp Basic  試劑盒（ 96 次）
5.TwistAmp exo RT  試劑盒（ 96 次）
6.TwistAmp Basic RT  試劑盒（ 96 次）
7.TwistFlow Salmonella 沙門氏菌試劑盒（ 24 次）檢測是否含有沙門氏菌的試劑盒與  Milenia Hybridtech 2 橫向流試劑條配套使用）
8.TwistGlow Salmonella 沙門氏菌試劑盒（ 96 次）檢測是否含有沙門氏菌的試劑盒
9.TwistFlow Red Snappe 紅魚試劑盒（ 8 次） 檢測是否為紅 魚的試劑盒
10.TwistAmp exo +ListeriaM 李斯特菌試劑盒（ 96 次）檢測是否含有李斯特菌的試劑盒
11.TwistAmp exo + Campylobacter 彎曲菌試劑盒（ 96 次）檢測是否含有彎曲菌的試劑盒
12.Milenia Hybridtech 1 側(cè)向流試劑條
13.Milenia Hybridtech 2 側(cè)向流試劑條
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