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乙酰輔酶A含量檢測(cè)試劑盒(微量法100T/96S)

貨號(hào) SH0253 售價(jià)(元) 9000
規(guī)格 100T/96S CAS號(hào)
  • 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
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貨號(hào)

名稱

規(guī)格

SH0253

乙酰輔酶A含量檢測(cè)試劑盒(微量法100T/96S)

100管/96樣

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義:

乙酰輔酶A廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個(gè)樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化,經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水,釋放能量用于ATP合成。此外,乙酰輔酶A是合成脂肪酸,酮體,膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。

測(cè)定原理:

蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng),乙酰輔酶A含量和NADH的生成速率成正比,340nm下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶A含量的高低。

組成:

產(chǎn)品名稱

SH0253-100T/96S

Storage

試劑一:液體

100ml

4℃

試劑二:粉劑

1

-20℃

試劑三:液體

10μl

4℃

試劑四:粉劑

1

-20℃

試劑五:液體

30ml

4℃

說明書

一份

 

試劑二:粉劑×1支,-20℃保存。臨用前加入250μl試劑五充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑三:液體10uL×1支,4℃保存。臨用前加入250μl試劑五充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑四:粉劑×1瓶,-20℃保存。臨用前加入22.5ml試劑五充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

工作液的配制:臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用工作液體積(樣本數(shù)×0.23 ml),將試劑二、三和四按照1:1:90的比例混合,或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻(可以測(cè)定96樣);加樣前37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴鍋中預(yù)熱30 min;現(xiàn)配現(xiàn)用;

自備儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

乙酰輔酶A的提取:

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(ml)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(ml)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1ml試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟:

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,用蒸餾水于340nm處調(diào)零。

2、 將工作液37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴鍋中預(yù)熱10 min。

2、取25μl樣本和230μl工作液至微量石英比色皿或者96孔板,混勻,立即記錄340nm20s的吸光值A180s時(shí)的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A2-A1

乙酰輔酶A含量計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1640x + 0.012;x為吸光值,y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/ml)。

注意:本試劑盒最低檢測(cè)限為1.6nmol/ml。

1)按照蛋白濃度計(jì)算

乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA0.012) ÷Cpr

需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

乙酰輔酶A含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA0.012) ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

乙酰輔酶A含量(nmol/104)=[(1640×ΔA0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA0.012)÷500

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.025ml;V2:加入提取液體積,1 ml;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 3280x + 0.024;x為吸光值,y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/ml)。

注意:本試劑盒最低檢測(cè)限為1.6nmol/ml

1)按照蛋白濃度計(jì)算

乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)=(3280×ΔA0.024) ÷Cpr

需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

乙酰輔酶A含量(nmol/g 鮮重)=[(3280×ΔA0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(3280×ΔA0.024) ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

乙酰輔酶A含量(nmol/104=[(3280×ΔA0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)=(3280×ΔA0.024)÷500

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.025mlV2:加入提取液體積,1 ml;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/ml;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

 

 

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